Strumento di ricerca forense basato sull’uso di fagi per la visualizzazione spaziale di contaminanti batterici nel formaggio
Abstract
Le procedure tradizionali per i test microbici in genere comportano una fase di omogeneizzazione. Questi metodi forniscono preziose informazioni sulla presenza o sull’enumerazione di un contaminante batterico, ma non su dove si trovasse all’interno del campione originale. Le informazioni spaziali potrebbero essere utili nella risoluzione dei problemi relativi alle fonti di contaminazione batterica in un impianto di lavorazione. Ad esempio, se il contaminante fosse localizzato sulla superficie di un alimento come il formaggio, ciò potrebbe indicare la condensa gocciolante lungo una linea di lavorazione specifica come fonte. L’obiettivo di questo studio di proof-of-concept era di valutare l’uso di un fago geneticamente modificato per rilevare contaminanti batterici sui formaggi in modo da poter visualizzare tali contaminanti senza l’uso dell’ingrandimento ottico. In questo studio, un batteriofago T7 progettato per sovraesprimere la luciferasi NanoLuc (Promega, Madison, WI) è stato utilizzato per rivelare la posizione spaziale di Escherichia coli su agar brodo di lisogenia (LB) e queso fresco (QF). Sono stati testati quattro scenari per esplorare come applicare il fago, con un segnale blu bioluminescente che rivela la posizione spaziale dei contaminanti: (1) fago applicato localmente tramite agar morbido colato a agar inoculato con E. coli (a) LB o (b) QF; e (2) fago incorporato in (a) LB agar o (b) QF e quindi inoculato con E. coli. Ciascuna situazione è stata testata in triplicato. Le colture di E. coli BL21 coltivate per 18 ore sono state diluite in serie in soluzione salina tamponata con fosfato e inoculate su 8 ± 0,5 g di LB agar o QF in piastre da 6 pozzetti. Le piastre sono state incubate a 37 °C per 8 ore per la condizione 1a, 24 ore per 1b e 2b e 22 ore per 2a. Per 1a e 1b, il fago è stato aggiunto all’agar morbido colato, applicato localmente e incubato per altre 2 ore per consentire l’infezione da E. coli. Dopo l’incubazione, il substrato NanoGlo (Promega) è stato aggiunto per coprire la superficie dell’agar o del formaggio e ripreso immediatamente in una scatola scura usando una fotocamera digitale e una lunga esposizione per catturare il segnale bioluminescente. Le fotografie hanno catturato piccoli punti blu in cui erano situate le unità formanti colonie incubate. Il livello di inoculo più basso di E. coli rilevato per ogni scenario era 1,43 × 101 ± 9,94, 1,18 × 101 ± 7,07, 5,48 × 101 ± 1,19 × 101 e 2,37 × 101 ± 1,40 × 101 ufc/pozzetto, per 1a, 1b, 2a e 2b, rispettivamente. Questi dati dimostrano che il proof-of-concept del fago “reporter” potrebbe essere usato come strumento di ricerca per visualizzare la posizione spaziale dei batteri in una matrice di formaggio. Il lavoro futuro tradurrà questo concetto in sistemi fago-patogeni rilevanti per i latticini.
Parole chiave: ricerca basata sui fagi, formaggio, luciferasi, NanoLuc
