Review: Raccomandazioni per la divulgazione degli studi sulla performance riproduttiva nella bovina da latte. Migliorare la pianificazione, l’analisi e l’interpretazione delle ricerche in campo riproduttivo. (Prima parte)

A causa della diversità dei fattori che influenzano la performance riproduttiva e delle complicate interazioni tra questi ultimi, si propongono delle linee guida per un approccio sistematico alla pianificazione, allo svolgimento ed all’analisi di studi che riguardino la riproduzione bovina. Si tratta di raccomandazioni, adattate dal REFLECT (Reporting Guidelines for Randomized Trials for Livestock and Food Safety) , che possono incrementare la validità interna ed esterna dello studio o l’inclusione dei lavori nelle meta-analisi e nelle revisioni sistematiche.

La bassa ereditabilità del carattere “fertilità” sottolinea come esso sia complesso e multifattoriale. Molti lavori che analizzano l’aspetto genetico di questo carattere non prendono in considerazione l’influenza di fattori ambientali come la gestione degli animali in età giovanile, l’ambiente dove essi vivono, il comfort delle stalle, la gestione del periodo di transizione, l’alimentazione, la stagione, il clima, la presenza di malattie. Altrettanto importante è la pianificazione di trial randomizzati con gruppo di controllo dove il campione di animali sia adeguato dal punto di vista numerico. Alcune delle mancanze riscontrabili nei lavori sono l’assenza di una chiara e dettagliata descrizione della randomizzazione o dell’applicazione di uno studio in cieco, l’uso di placebo o di precisazioni riguardanti la somministrazione degli alimenti (esempio: la razione veniva distribuita al gruppo o al singolo animale?).  La descrizione precisa delle condizioni ambientali, permette di individuare nuove covariate (fattori) da considerare nell’analisi statistica e di comparare risultati di studi differenti.

Le ipotesi che gli Autori intendono verificare durante il lavoro devono essere enunciate chiaramente e distinte in due livelli: principali e secondarie. Le ipotesi principali sono quelle di interesse primario nell’esperimento. Nel caso in cui si tenti di testare un numero elevato di ipotesi principali si rischia di incrementare l’errore statistico di tipo I, perciò è preferibile ridurre le ipotesi da verificare ed eliminare possibili fattori di confondimento.

Gli Autori dovrebbero identificare la specie oggetto di studio anche dal punto di vista tassonomico (Bos taurus ecc.), aggiungendo quante più informazioni possibili circa età, sesso, razza, stato produttivo. Ciò al fine di facilitare la ricerca informatizzata nei database scientifici: l’algoritmo di ricerca di un computer potrebbe non accorgersi che sia la parola “vacca” sia “manza” si riferiscono entrambe a categorie della specie Bos taurus. Altrettanto importante è identificare e distinguere l’unità sperimentale dall’unità di analisi statistica; ad esempio, l’unità sperimentale può essere rappresentata da un box di animali, mentre l’unità di analisi può coincidere con la singola bovina.

Quando si effettua un trattamento, dichiarare “… in accordo con le indicazioni del produttore…” può essere insufficiente. Occorre descrivere con maggior dettaglio possibile il tipo di principio attivo utilizzato, la sua concentrazione, il dosaggio, la via di somministrazione. L’aggiunta di tabelle e grafici per descrivere le tempistiche di somministrazione di alcuni trattamenti in relazione ad esempio ai giorni in lattazione, potrebbe facilitare la comprensione del lettore. Sebbene, a differenza dei lavori in medicina umana, il paziente animale non necessiti di essere all’oscuro di un trattamento ricevuto per dichiararne o smentirne l’efficacia, l’adozione di uno studio in cieco offre vantaggi in fase di analisi dei risultati. Sarebbero evitati, infatti, quei fattori di confondimento che potrebbero derivare da una gestione diversificata, da parte del personale addetto, degli animali sottoposti al trattamento rispetto al gruppo controllo. Nel caso di studi sugli effetti della somministrazione di un nuovo tipo di alimento, condurre un lavoro in cieco può essere impossibile; in questo caso, gli Autori dovrebbero dichiarare e discutere gli eventuali bias derivanti. Allo stesso modo, la descrizione dettagliata della composizione della razione o del pascolo, del grado di protezione ruminale per alcuni composti, dell’intervallo di tempo e della stagione durante la quale il lavoro si è svolto permette di analizzare, discutere e comparare tali covariate (fattori) in fase di discussione dei risultati o nel caso di meta-analisi. L’utilizzo di kit analitici, anche se prodotti per una specie di destinazione diversa, è sicuramente più pratico ed economico rispetto ai metodi RIA. Gli Autori, tuttavia, dovrebbero tentare di impiegare metodiche validate per la specie di destinazione e riportare nel dettaglio le caratteristiche del test (sensibilità, specificità e percentuale di cross-reattività, tasso di decadimento radioattivo, curva di standardizzazione…). I campioni sono generalmente analizzati in duplicato e di conseguenza andrebbe comunicato anche il coefficiente di variazione intra- ed inter-analisi. Ad esempio, quando un kit ELISA è utilizzato per la quantificazione di un ormone in un campione biologico, dovrebbero essere esplicitati la specificità dell’anticorpo per l’antigene principale, la descrizione della curva di standardizzazione, la sensibilità del metodo, il parallelismo e la linearità dell’analisi per campioni diluiti, la percentuale di recupero della massa aggiunta, il coefficiente di variazione intra- ed inter- analisi e comparazioni dei risultati ottenuti da altri test RIA o ELISA.

Quando uno dei risultati considerati è un parametro riferibile alla performance riproduttiva gli Autori dovrebbero descrivere il “voluntary waiting period” (VWP) applicato all’unità sperimentale e definire di conseguenza il momento di inizio del breeding period come giorni di VWP +1.

Per calcolare una adeguata numerosità del campione in genere si considera una potenza dell’esperimento (1 – β) dell’80% ed il rischio di errore di primo tipo del 5% (α). Nei lavori che intendono mettere in evidenza l’effetto di un trattamento su una performance, la stima dell’effetto sarà data dalla differenza tra la media del gruppo trattato e del controllo, diviso per la deviazione standard cumulata dei due gruppi. In genere più piccola è la differenza da evidenziare, più grande sarà il campione richiesto. Ad esempio, per individuare l’efficacia di un trattamento che aumenti la probabilità di gravidanza per una inseminazione dal 35 al 40% con una potenza (1 – β)= 0.8 e α=0.05 si necessiterà di 1471 bovine per gruppo (trattamento e controllo). Potrebbero essere necessari ulteriori animali per controllare errori dovuti al raggruppamento o alle perdite nel corso dell’esperimento.

Errori comuni si rinvengono in fase di analisi statistica. Assegnare le corrette proprietà alle variabili oggetto di studio (continue, ordinali, dicotome, distribuzione normale…) permette di utilizzare il test statistico più appropriato e diminuire il rischio di errore tipo I. Per le variabili dicotome l’utilizzo della regressione logistica con produzione di un odds ratio rappresenta l’approccio corretto. Se la variabile “risultato” interessa più del 10-20% delle unità di studio (ad esempio, la probabilità di gravidanza per inseminazione), allora l’uso del risk ratio e della regressione di Poisson è preferibile. Quando il “risultato” è un intervallo di tempo tra due eventi (inseminazione, gravidanza, perdita di gravidanza, riforma) il test più indicato è “l’analisi di sopravivvenza”. E’ errore comune analizzare il tempio medio per un evento tramite la regressione lineare, escludendo dall’analisi quelle unità che non hanno sperimentato l’evento stesso. Ciò introduce un bias che si esplicita con una errata stima della varianza tra i soggetti inclusi. L’effetto “clustering”, ossia l’influenza che alcuni metodi di raggruppamento (stessa azienda, stesso recinto…) possono esercitare sui risultati, devono essere tenuti in considerazione tramite l’adozione di modelli statistici con effetti fissi o random.

E’ esperienza comune che alcuni animali siano persi nel corso dello studio (riforma, malattia, morte…) prima che questo termini. I criteri di esclusione devono essere dichiarati e devono generalmente rispettare due assunzioni: 1) tutti i dati esclusi hanno sperimentato l’evento causa di esclusione nel momento in cui sono stati esclusi; 2) nessun dato escluso ha subito per lungo tempo l’evento causa di esclusione prima di essere escluso.

In fase di discussione dei risultati è tanto importante enunciare i benefici e i nuovi concetti introdotti dallo studio, quanto analizzarne i bias ed i punti di debolezza. E’ fondamentale interrogarsi sulla validità interna ed esterna del lavoro. La prima è massima quando tutte le covarianti sono controllate, per cui una misurazione effettuata su una unità del campione può essere ripetuta su un’altra unità del campione medesimo con il minimo errore di misurazione. Tuttavia, le conclusioni cui si perviene quando le covarianti sono strettamente controllate (es.: studio in condizioni di laboratorio) potrebbero non essere applicabili alle condizioni di campo e/o sul resto della popolazione (validità esterna). Gli studi con la massima validità esterna sono i trial clinici randomizzati con gruppo di controllo, gli studi multicentrici e le meta-analisi che da questi derivano. Di conseguenza, ogni discussione dovrebbe puntualizzare quanto dei risultati possa essere affermato anche al di fuori delle condizioni di esperimento. I risultati andrebbero confrontati con quelli di studi simili; se ciò non fosse possibile gli Autori dovrebbero sottolineare questa limitazione in vista di una interpretazione su vasta scala dei propri dati.

Infine, si dovrebbe specificare l’origine dei fondi con i quali la ricerca è stata eseguita e possibili conflitti di interesse.