L’infezione da Mycobacterium avium sottospecie paratuberculosis (MAP) è causa della malattia di Johne o paratubercolosi, una patologia a decorso cronico dei ruminanti. MAP è in grado di sopravvivere alla pastorizzazione e può entrare nella catena alimentare umana attraverso i prodotti lattiero-caseari, la carne e le acque reflue non adeguatamente trattate. Esistono diversi test diagnostici per individuare gli animali affetti, ma la loro efficacia varia considerevolmente in base a diversi fattori tra cui lo stadio della malattia. Si possono classificare tre fasi:
- L’animale non elimina MAP nell’ambiente e non mostra segni clinici
- MAP viene diffuso ma l’infezione rimane subclinica
- Vi è sia eliminazione di MAP con le feci sia la presenza di segni clinici
Questa review espone lo stato attuale delle conoscenze circa l’esistenza e l’applicabilità dei test diagnostici per l’infezione da MAP nei bovini.
Generalmente i segni clinici si manifestano negli animali di oltre 24 mesi di età, ma solo il 10-15% degli infetti svilupperà segni di malattia. Tra questi, vi sono l’ispessimento della parete intestinale, l’aumento di volume dei linfonodi meseraici e dei vasi linfatici regionali. Le lesioni granulomatose sono individuate principalmente nell’ileo e nei linfonodi drenanti ma è possibile il coinvolgimento del grande intestino o di altri tratti. Le sezioni istologiche sono normalmente colorate con ematossilina-eosina o con la tecnica Ziehl Neelsen. Oltre che in sede autoptica, le sezioni istologiche possono essere ottenute tramite prelievo bioptico, ma le lesioni sono difficili da osservare in animali giovani o negli stati iniziali della malattia.
MAP è un organismo con crescita particolarmente lenta e una coltura a scopo diagnostico richiede un tempo molto lungo per la realizzazione. Inoltre i ceppi specifici per bovini e ovini richiedono condizioni di crescita differenti. La sensibilità della coltura da campione di feci da animali sintomatici è di circa il 70%, mentre nei casi subclinici varia tra il 23 ed il 29%. L’isolamento da campioni di tessuto intestinale è più sensibile e può individuare il patogeno in animali infetti ma non ancora eliminatori di MAP.
La reazione a catena della polimerasi (PCR)è uno strumento diagnostico rapido applicabile a campioni fecali, bioptici e di latte, ma la coltura da campione fecale rimane tuttora il gold standard.
Il dosaggio dell’interferone γ individua una riposta immunitaria cellulo-mediata in seguito ad infezione con MAP: l’aumento del metabolita si verifica prima dell’eliminazione fecale del patogeno, ma la produzione di interferone diminuisce man mano che la patologie progredisce e non si correla con l’intensità di eliminazione fecale di MAP. Ad ogni modo, in uno studio danese l’età media dei capi positivi al dosaggio dell’interferone γ era di 26 mesi mentre la positività alla coltura fecale era raggiunta a 37 mesi in media.
Le tecniche ELISA, per l’identificazione di anticorpi contro MAP, possono essere applicate a diverse matrici quali siero, latte individuale e di massa. L’ELISA fornisce un risultato in tempi brevi e con costi contenuti ma sono possibili falsi negativi nelle fasi iniziali dell’infezione: la sensibilità di tale metodica è del 50-87% in animali con segni clinici, del 24-94% quando l’infezione è subclinica ma vi è eliminazione fecale del patogeno, per diminuire al 7-22% negli animali subclinici non eliminatori.
Una tecnica di recente introduzione prevede l’utilizzo di batteriofagi (virus) specifici per MAP. Con tale metodica è possibile individuare cellule di MAP vitali fino alla soglia di 1-10 unità formanti colonie (CFU)/mL nell’arco di tempo di 2 giorni. Sono però possibili falsi positivi dovuti a contaminazione del campione o falsi negativi per presenza di un numero insufficiente di cellule/mL o per resistenza del ceppo di MAP al batteriofago utilizzato.
L’arricchimento delle tecniche ELISA con nuovi antigeni ricombinanti (MAP1693c, MAP4308c, MP2677c) per la discriminazione di animali sani ed infetti, ha permesso di migliorare la capacità diagnostica della metodica. L’utilizzo dell’antigene lipopentopeptide (L5P) ha permesso di distinguere animali infetti da MAP e bovini infetti da M. bovis.
L’analisi trascrittomica può rivelare alterazioni dell’espressione genica nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMCs) di animali infetti rispetto ai sani. Alcuni kit possono essere utilizzati con successo anche in vitelli di 3, 6 e 9 mesi di vita; le principali differenze riguardano la trascrizione di geni implicati nella risposta infiammatoria come quelli codificanti per il CD46, il peptide BNBD-like e l’antigene BOLA, ma si tratta di metodiche che richiedono ancora una validazione.
I micro RNA (miRNA) sono catene di nucleotidi non codificanti costituite di 19-25 unità; essi influenzano la regolazione post-trascrizionale dei geni, possono fornire informazioni sulle attività metaboliche delle cellule e sono individuabili in ogni fluido corporeo. In medicina umana l’analisi dei miRNA può essere utilizzata con successo per discriminare pazienti positivi per M. tuberculosis da quelli negativi o affetti in maniera subclinica. Il potenziale diagnostico dei miRNA nella specie bovina deve ancora essere esplorato.
Anche l’analisi della composizione del microbioma può fornire informazioni circa lo stato infettivo dell’animale. Il microbioma contribuisce all’omeostasi dell’organismo e alla funzione immunitaria, influenzando anche il decorso dell’infezione da MAP. Il semplice sequenziamento dell’RNA ribosomiale non fornisce informazioni circa la reale funzionalità della popolazione batterica e può comunque restituire dei falsi negativi quando un genere batterico è scarsamente rappresentato. Nell’uomo, in corso di morbo di Crohn o IBS si ha diminuzione delle popolazioni del genere Firmicutes in confronto ai soggetti sani. Sono ancora scarsi gli studi analoghi condotti nella specie bovina, ma sono riportate differenze nella composizione del microbioma in bovini MAP-positivi e sani. L’interpretazione delle informazioni restituite dall’analisi del microbioma è complicata dalle interazioni tra la genetica dell’ospite, l’alimentazione, l’ambiente e le pratiche di gestione, tutti fattori che possono influenzare la popolazione batterica gastroenterica.
In conclusione, le conoscenze attuali circa la patogenesi dell’infezione dal MAP non sono ancora complete, così come l’efficacia delle tecniche diagnostiche disponibili può essere implementata. I test attualmente in uso presentano sensibilità e specificità variabili in base allo stadio dell’infezione e alla presenza/assenza di segni clinici. Una diagnosi precoce è auspicata in quanto permetterebbe di migliorare il controllo della malattia. Sono necessari studi standardizzati e su ampia scala che indaghino l’impatto delle metodiche diagnostiche emergenti sulla possibilità di individuazione precoce dei soggetti malati.
Potential application of emerging diagnostic techniques to the diagnosis of bovine Johne’s disease (paratuberculosis)
Britton L. E. et al.
The Veterinary Journal 209 (2016) 32-39
