Si stima che il 25% delle derrate alimentari agricole sia contaminato da micotossine e che più di 4.5 miliardi di persone siano cronicamente esposte alle aflatossine. Le aflatossine più importanti sono prodotte principalmente da Aspergillus flavus e da A. parasiticus e possono essere responsabili di intossicazioni sia acute (epatite, edema, necrosi emorragica dei parenchimi) sia croniche (carcinoma epatico, polmonare, renale e immunosoppressione). Alla aflatossina B1 (AFB1) si attribuisce anche potere teratogeno e mutagenico. L’Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro (IARC) la definisce come la sostanza carcinogenica più importante tra quelle finora note. Nell’allevamento zootecnico le aflatossine sono responsabili di performance ridotta, aumentata suscettibilità alle infezioni, alterata risposta alla vaccinazione e contaminazione dei prodotti derivati dagli animali (carne, uova, latte). In particolare, nel latte si rileva la presenza di aflatossina M1 (AFM1), la cui tossicità eguaglia quella di AFM1 e alla quale la IARC attribuisce sospetto potere cancerogeno. Durante la caseificazione la AFM1 si lega alla caseina così da essere concentrata nel prodotto finale ed incrementando il rischio di esposizione per il consumatore.
Nei paesi industrializzati i limiti di tolleranza per la presenza di AFM1 nel latte variano tra 0.05 μg/Kg (Europa) a 0.5 μg/Kg (USA); i lotti di prodotto non conforme sono distrutti con notevoli perdite economiche, mentre i metodi più comunemente utilizzati per ridurre la presenza di aflatossine comprendono l’aggiunta di agenti sequestranti negli alimenti destinati agli animali.
La produzione di un vaccino capace di indurre risposta anticorpale in grado di neutralizzare la AFB1 potrebbe essere di grande valore sociale, scientifico ed economico. Le normali tecniche di produzione vaccinale non sono sufficienti a garantire una reazione immunitaria a causa della scarsa immunogenicità della AFB1.
Lo scopo di questo lavoro è stato verificare se la produzione di una forma modificata di AFB1 (AnAFB1), privata di tossicità e mutagenicità ma con potere immunogeno incrementato dalla coniugazione con una proteina carrier, potesse essere efficace nel prevenire il carry over di AFM1 nel latte di vacche alimentate con diete contaminate da AFB1.
Prima della somministrazione della AnAFB1 vaccinale, la tossicità e la mutagenicità del candidato vaccino sono state verificate in vitro su colture di cellule derivate da epatocarcinoma umano (tossicità) e su ceppi di Salmonella typhimurium TA98 e TA100 (mutagenicità). In entrambi i casi si raggiungevano risultati compatibili con la successiva sperimentazione in vivo.
Si procedeva con la somministrazione intramuscolo nella regione del collo di 1 mL del vaccino contenente 500 μg di AnAFB1 coniugato con proteina KLH in associazione ad adiuvante di Freund in 6 vacche in lattazione (6 vacche controllo ricevevano solo KLH). La prima dose era inoculata a 85±21 giorni di lattazione ed era seguita da 3 dosi booster.
La titolazione anticorpale tramite metodo ELISA alla decima settimana permetteva di individuare due gruppi di animali tra quelli cui era somministrato il vaccino per AnAFB1: “high responders” e “low responders” (titolo anticorpale da 10000 e 40000, e tra 1000 e 4000, rispettivamente). Nessuno degli animali immunizzati rispondeva positivamente al test tubercolinico, ad indicare che nessuna interferenza era presente.
L’analisi dei campioni di latte prelevati durante il periodo di intossicazione sperimentale (somministrazione di alimento contaminato) evidenziavano tenori di aflatossina M1 inferiori nelle vacche vaccinate rispetto ai controlli. L’andamento della concentrazione di M1 aumentava ad ogni mungitura e raggiungeva un plateau a 7 giorni in entrambi i gruppi. Al giorno 11, quando il periodo di intossicazione sperimentale terminava, i livelli di M1 decrescevano per tornare ai livelli iniziali il giorno 16. Ad ogni modo, il tenore di aflatossina M1 nel latte delle bovine vaccinate era mediamente del 20% inferiore rispetto agli animali controllo, sebbene la differenza tra i due gruppi non fosse statisticamente significativa. Nel dettaglio, il gruppo “high responders”, con titolazioni anticorpali maggiori, presentava concentrazioni medie di AFM1 nel latte del 46% inferiori (significatività P<0.05) rispetto ai controlli (95 ng/Kg versus 177 ng/Kg). Risultato simile si otteneva durante un secondo periodo di intossicazione sperimentale, con le bovine (in tarda lattazione) sottoposte a vaccinazione che presentavano concentrazioni di aflatossina inferiori nel latte rispetto ai controlli.
I risultati mostrano come la risposta anticorpale (principalmente IgG) verso l’aflatossina B1 modificata e coniugata con proteina carrier KLH può ridurre efficacemente l’effetto carry over della AFM1 nel latte delle bovine trattate che ingeriscano alimenti contaminati. Nelle bovine “high responders” l’effetto della vaccinazione perdura anche negli stati avanzati della lattazione, suggerendo che la risposta immunitaria abbia durata sufficiente a proteggere l’animale durante tutto il ciclo produttivo, fino alla messa in asciutta. La ragione per cui animali in buona salute possano rispondere diversamente alla stimolazione vaccinale (“high” e “low responders”) non è chiara; è noto che la componente genetica può influenzare la responsività immunitaria del soggetto, ma vi sono interazioni anche con il bilancio energetico, lo stress peripartale e lo stadio di lattazione dell’animale. E’ possibile che formulazioni vaccinali adeguate (adiuvanti o carrier diversi) possano stimolare adeguatamente la risposta immunitaria negli animali “low responders”.
La riduzione della AFM1 nel latte osservata nelle bovine “high responders” era comparabile all’effetto ottenuto tramite aggiunta di sequestranti nell’alimento, suggerendo che l’adozione contemporanea di entrambe le pratiche possa rendere più efficace la prevenzione del carry over di AFM1 nel latte.
Vaccination of lactating dairy cows for the prevention of Aflatoxin B1 carry over in milk
Luciano Polonelli et al.
PLoS One. 2011;6(10):e26777.
doi: 10.1371/journal.pone.0026777
