Indicatori neurobiologici per la valutazione del benessere animale di bovine da latte in allevamento intensivo

Sintesi

Il presente progetto di ricerca articolato in due workpackages (WP) si poneva quali obiettivi l’identificazione mediante un approccio metabolomico e neurobiologico di nuovi indicatori di benessere “animal based” in ambito zootecnico e l’individuazione di end points umanitari nel modello suino di SLA hSOD1G93A. A tal fine, nell’ambito del primo WP, sono stati identificati, quale modello di studio, tre allevamenti di bovine da latte con differenti tipologie di stabulazione (fissa, libera e libera con alto livello di produttività). Il modello individuato si è dimostrato molto efficace quando investigato mediante approccio neurobiologico, permettendo di esaltare condizioni particolarmente stressanti per gli animali quali, fra gli altri, la stabulazione fissa alla catena e l’elevata produttività. Lo studio neurobiologico ha permesso di identificare nuovi fattori coinvolti nella risposta allo stress che, una volta validati, potranno essere impiegati quali possibili indicatori di benessere.

Introduzione

La tutela del benessere degli animali zootecnici in allevamento intensivo è divenuto un fattore sempre più stringente e determinante per l’opinione pubblica che richiede alimenti sani, di qualità e prodotti eticamente. Per questo motivo è forte l’esigenza di definire indicatori standardizzati, messi a punto su solide basi scientifiche, che possano essere utilizzati per valutare il livello di benessere animale di un allevamento utilizzando parametri unici e condivisi. Al momento, infatti, nessuno dei saggi validati è in grado di fornire un quadro esaustivo circa le condizioni di benessere individuale di un animale. Sebbene condizioni di stress diano origine a variazioni comportamentali ed a livello di sistema neuroendocrino, un approccio neurobiologico per identificare biomarcatori di benessere, ed in particolare di benessere mentale, negli animali da allevamento è stato poco investigato. Le neurotrofine sono coinvolte nell’eziopatogenesi del disturbo depressivo stress-correlato e numerosi studi riportano alterazioni del fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) e della via della chinurenina in diversi disturbi neuropsichiatrici umani [1,2]. In questo contesto, il gruppo capofila del presente progetto, ha misurato i livelli di espressione e di attività del BDNF e della indolamine 2,3-diossigenasi (IDO1), enzima coinvolto nella conversione del L-triptofano in chinurenine, nel plasma e nel sistema nervoso centrale di vacche da latte allevate in tre diverse condizioni di stabulazione (libera, libera spinta, fissa). Il gruppo capofila del presente progetto ha inoltre svolto un’intensa attività di ricerca per l’individuazione di end points umanitari nel modello suino di SLA hSOD1G93. Tuttavia, questi risultati saranno oggetto di una prossima trattazione dato che ad oggi solo un suino transgenico su tre ha raggiunto la fase conclamata di malattia.

Materiali e metodi

Vacche da latte provenienti da tre diverse aziende sono state classificate in 3 gruppi: gruppo A (stabulazione libera, n = 13); gruppo B (stabulazione fissa, n = 13) e gruppo F (stabulazione libera con alto livello di produttività, n = 13). Ogni allevamento è stato valutato da un punto di vista gestionale mediante l’applicazione del protocollo di valutazione Classyfarm. Gli animali sono stati sottoposti a prelievo di sangue con cadenza trimestrale (T0, 12.06.17; T1, 26.9.17; T2, 30.01.18). Le concentrazioni plasmatiche di BDNF sono state misurate usando un saggio immunoenzimatico quantitativo (Boster Biological Technology) testando in doppio tutti i campioni raccolti. Campioni di cervello sono stati inoltre raccolti da 11 animali (A n = 4, B n = 2, F n = 5) a fine carriera e analizzati mediante western blot per valutare i livelli di espressione della forma matura del BDNF (mBDNF, 15KDa) e del suo precursore (proBDNF, 32 kDa). La rivelazione della proteina è stata condotta con l’anticorpo monoclonale anti-BDNF ab108319 (AbCam). Per la quantificazione dell’intensità del segnale è stato utilizzato il software di analisi d’immagine ImageLab (Biorad). Inoltre, mediante saggio fluorimetrico (BioVision) è stata misurata l’attività specifica IDO1 a livello di corteccia e di talamo per ogni encefalo campionato.

Risultati e conclusioni

Nella figura 1 sono riportate le concentrazioni medie (picogrammi/mL) del BDNF plasmatico determinate mediante tecnica ELISA (Range curva standard: 31,2 pg/ml – 2000 pg/ml; Sensibilità: <2 pg/ml) e calcolate su tutti i campioni di plasma bovino suddivisi per azienda agricola e tempo di prelievo.

I gruppi sono poi stati confrontati mediante analisi della varianza, sia non parametrica (Kruskal Wallis – Regressione della mediana) che parametrica (ANOVA). Da entrambe le analisi si osservano differenze tra gli allevamenti. Con l’applicazione dell’ANOVA emergono differenze statisticamente significative tra i gruppi oggetto di studio sia con singola misurazione al T0 sia considerando le tre misurazioni a tempistiche differenti. In particolare, la concentrazione plasmatica del BDNF totale è risultata essere significativamente elevata nell’allevamento a stabulazione fissa rispetto a quello a stabulazione libera con alto livello di produttività. In una seconda fase i livelli di espressione del mBDNF e del proBDNF sono stati analizzati tramite western blot nell’ippocampo di 11 bovine da latte a fine carriera (Figura 2).

Tale analisi semi-quantitativa ha permesso di evidenziare una diversa ratio tra mBDNF e proBDNF con un livello minore di mBDNF nell’ippocampo degli animali mantenuti a stabulazione fissa rispetto agli animali a stabulazione libera (Figura 3).

Un altro aspetto particolarmente interessante è emerso dall’analisi delle indolammine 2,3-diossigenasi (IDO1), enzimi localizzati a livello di astrociti e microglia che catalizzano la conversione del triptofano in chinurenine a discapito della via serotoninergica. Infatti, le analisi hanno rivelato come gli animali dell’allevamento a stabulazione
libera con alto livello di produttività mostrassero a fine carriera un significativo aumento dell’attività specifica IDO1
rispetto agli animali dell’allevamento a stabulazione libera (Figura 4 e 5).

L’alterata attività IDO1 riscontrata lascia ipotizzare come un’eccessiva produttività possa rappresentare per gli animali un’importante fonte di stress inducendo una probabile riduzione dei livelli di serotonina circolanti. Tali risultati assumono una particolare importanza se si considera che il sistema di valutazione Classyfarm aveva attribuito all’allevamento a stabulazione libera spinta il punteggio migliore. I risultati ad oggi ottenuti, evidenziano come un ambiente povero di stimoli quale quello della stabulazione fissa possa inibire la conversione del precursore del BDNF nella sua forma matura rispetto agli animali mantenuti a stabulazione libera [3-6]. Inoltre, è stato osservato come lo stress indotto da un’eccessiva produttività determini un significativo aumento dell’attività specifica IDO1 rispetto a modalità di allevamento con indici di produttività più sostenibili dagli animali. Nel complesso, tali risultati confermano la validità dell’idea progettuale e del modello di studio adottato e rappresentano il punto di partenza per sviluppare ulteriori studi.

Bibliografia

1. Autry AE et al. (2012) Pharmacol Rev. 64(2): 238-258.

2. Shimizu E et al. (2003) Biol Psychiatry 54: 70-5.

3. Cao W et al. (2014) Behav Brain Res 265:76-83

4. Tognoli C et al. (2010) BMC Neurosci 11:4

5. Sodersten K et al. (2014) J Affect Disord 160:1-9

6. Wetsel WC et al. (2013) Proc Natl Acad Sci USA 110(43):17362–17367.