Srikanth Yellayi*, Afia Naaz*, Melissa A. Szewczykowski*, Tomomi Sato*†, Jeffrey A. Woods‡, Jongsoo Chang§, Mariangela Segre, Clint D. Allred§, William G. Helferich§║, e Paul S. Cooke*║** 
Departments of *Veterinary Biosciences, ‡Kinesiology, §Food Science and Human Nutrition, and Veterinary Pathobiology, and ║Division of Nutritional Sciences, University of Illinois, Urbana, IL 61802 
Edito da R. Michael Roberts, University of Missouri, Columbia, MO, e approvato il 18 Marzo, 2002 ( ricevuto per la review il 5 Decembre, 2001)

 

Introduzione

Metodi

Risultati e discussioni

Riferimenti

Introduzione

L’utilizzo di latte artificiale per neonati a base di soia e di integratori a base di isoflavoni della soia ha destato alcune preoccupazioni, a causa dei potenziali effetti estrogenici degli isoflavoni di soia cioè genisteina e daidzeina. In questo lavoro abbiamo mostrato come iniezioni s.c. di genisteina in topi adulti ovariectomizzati abbiano indotto una diminuzione dose-risposta (fino ad un 80%) del peso de timo. Gli effetti della genisteina sul timo si esplicano sia mediante il coinvolgimento di meccanismi relativi al recettore dell’estrogeno (ER) sia in assenza di questi meccanismi, e questo è stato provato dal fatto che gli effetti della genisteina sul timo sono stati limitati solo parzialmente dall’antagonista dell’ER ICI 182.780. La genisteina ha indotto una diminuzione dell’86% del numero di timociti e ha raddoppiato gli eventi apoptotici, indicando così che il suo effetto sulla perdita dei timociti è causato in parte anche da un aumento dell’apoptosi. L’iniezione di genisteina ha causato una diminuzione delle percentuali relative di CD4+CD8– e dei timociti doppio-positivi CD4+CD8+, fornendo la prova che questo isoflavone può influenzare la maturazione dei timociti precoci e della linea cellulare Thelper CD4+CD8–. Diminuzioni delle percentuali relative di timociti CD4+CD8–  erano accompagnate da una diminuzione delle percentuali relative delle cellule CD4+CD8– spleniche e da una linfocitopenia sistemica. Inoltre, la genisteina ha causato una soppressione dell’immunità umorale. Iniezioni di genisteina a dosi di 8 mg/kg al giorno, hanno prodotto dei livelli sierici di questo isoflavone paragonabili a quelli riportati in neonati umani alimentati con soia e, nei topi, questa dose ha provocato cambiamenti significativi a carico del timo e del sistema immunitario. In sostanza, la genisteina fornita con la dieta a concentrazioni che generavano livelli sierici di questo isoflavone sostanzialmente inferiori a quelli dei bambini alimentati con soia, induceva una marcata atrofia timica.

Questi risultati aumentano la probabilità che le concentrazioni di genisteina sierica riscontrate nei bambini alimentati con soia possano essere in grado di produrre anomalie del timo e del sistema immunitario, come suggerito da precedenti segnalazioni di deficit immunitari in neonati umani alimentati con la soia. 

Il latte artificiale a base di soia è ampiamente utilizzato. Negli Stati Uniti, il 25% circa dei lattanti alimentati con latte artificiale consuma formulazioni a base di soia (1). Questo numero rappresenta il 15% di tutti i bambini degli Stati Uniti o, all’incirca, 750.000 bambini all’anno (1, 2). I bambini che consumano latte artificiale a base di soia sono esposti ad elevati livelli di genisteina e daidzina, isoflavoni estrogenici presenti nei fagioli della soia e nei prodotti a base di essa. In media, i bambini alimentati con formulazioni a base di soia consumano 6.0-11.9 mg di isoflavoni/kg al giorno (3, 4), un valore molto più alto rispetto a quello degli adulti che seguono diete ad alto contenuto di soia. Nei bambini alimentati con soia, i livelli plasmatici totali di isoflavoni e genisteina variavano, rispettivamente, da 2.0 a 6.6 e da 1.5 a 4.4 μmol/l (3), risultando 10 volte superiori rispetto ai livelli registrati negli adulti giapponesi (la cui dieta include storicamente la soia), e questi livelli erano 200 volte più elevati rispetto a quelli plasmatici di neonati alimentati con latte vaccino o latte materno (3, 5). I livelli di genisteina non coniugata (aglicone) come percentuale di genisteina totale, erano più elevati nei cuccioli di ratto piuttosto che negli adulti (6), ma questi non sono stati misurati nei neonati umani. Se un simile evento si verificasse negli esseri umani, i livelli relativi degli agliconi liberi biologicamente attivi potrebbero essere superiori anche di 10 volte alla differenza documentata nei valori totali di isoflavoni sierici (liberi + coniugati) e nei livelli di genisteina riscontrati in bambini alimentati con soia rispetto a quelli di adulti che consumano diete ad elevato contenuto di soia. Nei bambini alimentati con soia, i livelli plasmatici totali di isoflavoni sono fino a 22.000 volte superiori rispetto ai livelli di 17β-estradiolo (E2) (3). Tuttavia, l’estrogenicità della genisteina è solo da 1/1.000th fino a 1/10.000th rispetto a quella di E2 (7). Inoltre, solo una piccola frazione di genisteina o daidzeina circolante è rappresentata da aglicone. Nonostante questo, nei bambini, alti livelli di genisteina potrebbero comunque avere effetti nonostante la limitata potenza estrogenica e la prevalenza in circolo di forme coniugate. Il lavoro condotto sugli effetti estrogenici dei fitoestrogeni si era concentrato soprattutto sugli organi riproduttivi (7). Tuttavia, il timo esprime sia il recettore degli estrogeni (ER) α che quello β, e il trattamento di roditori in via di sviluppo con estrogeni induce atrofia timica e soppressione immunitaria (8, 9). Nonostante l’affinità della genisteina per l’ERα e l’ERβ, i suoi effetti sul timo non erano stati studiati. Ci sono segnalazioni di eventuali effetti di alte concentrazioni  di genisteina su cellule immunitarie in vitro (10), ma non era chiaro se questi effetti si fossero manifestati anche a concentrazioni fisiologiche o in vivo.

Nel presente report, abbiamo esaminato gli effetti della genisteina sul timo e sul sistema immunitario dei topi. I nostri risultati indicano che le iniezioni di genisteina inducono una riduzione del peso del timo e del numero di linfociti TCD4+CD8- timici e splenici, generando linfocitopenia e soppressione immunitaria. La cosa più preoccupante è che l’atrofia timica si manifesta quando ai topi vengono somministrate dosi alimentari di genisteina che causano concentrazioni sieriche inferiori rispetto a quelle segnalate in neonati umani nutriti con soia. 

Metodi

Effetto della genisteina sul peso del timo, sull’apoptosi e sulle sottopopolazioni di timociti nei topi adulti

Topi femmina C57BL6 (Harlan Breeders, Indianapolis) sono stati ovariectomizzati una settimana prima dell’iniezione, per imitare le condizioni endocrine dei neonati umani, dove i livelli di E2 circolanti sono minimi sia nei maschi che nelle femmine (3). A partire da 2 giorni prima delle iniezioni sono stati alimentati ad libitum con una dieta priva di fitoestrogeni a base di caseina (AIN-93G). Ai topi (di 100 giorni d’età quando sono cominciate le iniezioni) è stata effettuata un’iniezione s.c./giorno per 7 o 21 giorni, o di 0.02 ml DMSO (controllo), o di E2 (5μg/kg al giorno) o di genisteina (Indofine Chemicals, Somerville, NJ) a 2-200 mg/kg al giorno. Abbiamo anche determinato gli effetti della genisteina sulla dimensione del timo nei maschi castrati. I maschi di settanta giorni d’età sono stati castrati e 5 giorni dopo sono stati sottoposti ad una dieta priva di fitoestrogeni. Dopo una settimana dalla castrazione, gli sono stati iniettati DMSO, E2 o genisteina (200 mg/kg di peso corporeo/giorno) per 21 giorni. L’immunofluorescenza diretta è stata utilizzata per analizzare le sottopopolazioni di linfociti nel timo delle femmine trattate con controllo e con genisteina. I linfociti timici (1×106) sono stati incubati con anticorpi CD4 anti-topo (L3T4, PharMingen) coniugati con ficocianina e con anticorpi CD8 anti-topo coniugati con ficoeritrina (LY-2, PharMingen). Le cellule sono state quindi fissate e circa 10.000 cellule sono state esaminate mediante la citometria a flusso (Coulter EPICS XL). Controlli appropriati sono stati eseguiti per ciascun campione. I timociti sono stati marcati con annessina V-FITC e ioduro di propidio (PI) utilizzando il kit di colorazione annexin-V-FLUOS (Roche Diagnostics), quindi  è stata quantificata l’apoptosi mediante citometria a flusso (11). La colorazione con annessina viene utilizzata per misura l’esteriorizzazione della fosfatidilserina, un fosfolipide che normalmente si trova nel lato interno della membrana cellulare e che è un marker delle fasi iniziali dell’apoptosi. Lo ioduro di propidio (PI) colora le cellule che presentano una marcata rottura della membrana plasmatica, che caratterizza le fasi successive della morte cellulare. L’utilizzo di annessina e PI consente un rilevamento simultaneo di cambiamenti apoptotici indipendenti (12). 

 Effetti della genisteina sull’immunità umorale e sulla percentuale dei linfociti ematici

Topi giovani (25-27 giorni) sono stati ovariectomizzati e,  dopo 5 giorni, alimentati con mangime senza fitoestrogeni. A partire da una settimana dopo l’ovariectomia, sono stati sottoposti ad iniezioni giornaliere di DMSO, E2 o genisteina (8-80 mg/kg al giorno) per 5 settimane. Una settimana dopo l’inizio del trattamento, i topi sono stati immunizzati con 100 μg  di emocianina della Megathura crenulata (keyhole limpet haemocyanin (KLH)) utilizzando la bentonite come adiuvante (13). Tre settimane dopo, è stata somministrata una dose di richiamo di KLH, quindi gli animali sono stati uccisi una settimana dopo, al termine del periodo di trattamento. Il siero è stato ottenuto a partire da misurazioni successive, in tutti i gruppi,  dell’anticorpo anti-KLH mediante tecnica ELISA (come descritto) (13) e sono stati determinati anche i pesi timici. Le sottopopolazioni di linfociti splenici sono state determinate come descritto in precedenza per i linfociti timici. È stato effettuato uno striscio con il sangue  degli animali utilizzati nello studio sull’immunità umorale. È stata eseguita la formula leucocitaria per ciascun campione ottenuto dal gruppo di controllo e dai vari gruppi trattati (n= 5-8). 

Misurazione dei livelli di genisteina nel siero di topi ai quali veniva iniettata o fornita con l’alimento

I livelli sierici di genisteina sono stati misurati in topi ovariectomizzati al giorno 25-27 ed alimentati con mangimi privi di fitoestrogeni, come nella sezione precedente. A partire da una settimana dopo l’ovariectomia, i topi hanno ricevuto due iniezioni giornaliere di uno dei seguenti prodotti: DMSO (n=6) o genisteina a 2, 8, 20, 80 e 200 mg/Kg. Ventiquattro ore dopo la seconda iniezione, il sangue è stato raccolto per decapitazione (tempo 0; n=6 da ogni gruppo), mentre ai topi rimasti è stata somministrata una terza iniezione e il sangue è stato raccolto a 0.5, 1, 2 e 6 ore dopo il dosaggio (n=5-6 per ogni punto temporale e trattamento). Per testare se la genisteina alimentare potesse avere effetti sul timo, abbiamo alimentato i topi ovariectomizzati dai 32 ai 34 giorni, o con una dieta priva di fitoestrogeni AIN-93G (controllo) o con questa dieta ma integrata con 1.000 o 1.500 ppm di genisteina (Dyets, Betlemme, PA). I topi sono stati uccisi all’accensione delle luci (ore 8:00) del dodicesimo giorno di alimentazione; i livelli sierici di genisteina in quel momento rispecchiavano i livelli osservati durante la notte, quando i topi stavano mangiando (14). I timi sono stati pesati e il sangue è stato raccolto per la successiva misurazione della genisteina. Per determinare i livelli di genisteina, il sangue è stato centrifugato e il siero è stato rimosso. La quantità di genisteina totale (aglicone+coniugata) è stata determinata utilizzando campioni raddoppiati di 50μl provenienti da ciascun animale. I campioni sono stati miscelati con volumi uguali di acetonitrile, sonicati per 10 minuti e centrifugati (15.000 rpm per 10 min). Per misurare la genisteina totale, il surnatante è stato combinato con 1 ml di tampone citrato di sodio (25 mM, pH 5.0) contenente β-glucuronidasi e solfatasi per deconiugare la genisteina. Dopo incubazione a 37° C per 4 h, il campione è stato caricato su una colonna C-18 SPE (J & W Scientific, Folsom, CA) e lavato con 30 ml di acqua distillata. La colonna lavata è stata eluita con 1,5 ml di metanolo, fatta evaporare sotto vuoto con centrifugazione e risospesa in metanolo per analisi HPLC. I campioni preparati sono stati separati mediante HPLC con una colonna C-18 Nova Pak (colonna da 3.9 x 150 mm, particelle da 4-μm,Waters) utilizzando un sistema a gradiente di solvente. Il solvente consisteva in una miscela tampone di sodio acetato (50 mM, pH 4.8) e metanolo (4: 1) e in una miscela tampone di sodio acetato, metanolo e acetonitrile (2: 2: 1). La portata del flusso era di 0.5 ml/min a una temperatura di 30°C. Per l’individuazione dell’isoflavone, è stato utilizzato un rivelatore Waters Photodiode Array (PDA), con il rilevamento compreso tra 210 e 400 nm. L’analisi aveva un limite minimo di rilevazione di 0.2 μmol/Litro (15). 

 Analisi statistiche

I risultati di tutti gli esperimenti sono stati analizzati mediante ANOVA ad una via, seguita dallo Student-Newman-Keuls Multiple Comparisons test e le differenze sono state considerate significative quando P < 0.05. 

Risultati e discussioni

La genisteina riduce le dimensioni del timo in topi maschi e femmine attraverso dei meccanismi mediati e non dagli ER

Abbiamo esaminato gli effetti timici e immunitari del trattamento con genisteina in topi ovariectomizzati, e abbiamo osservato come questo isoflavone abbia prodotto una diminuzione dose-risposta del peso e delle dimensioni del timo (Fig. 1). I pesi timici in femmine trattate con E2 (5μg/kg al giorno) erano diminuiti del 50% rispetto ai controlli; dosi di E2 più elevate (fino a 12 μg/kg al giorno) non hanno prodotto diminuzioni più marcate (non mostrate). Il peso del timo nelle femmine che assumevano 200 mg/kg di genisteina al giorno era inferiore del 78% rispetto ai controlli e più basso del 56% rispetto alle femmine trattate con E2. I pesi del timo nei gruppi con 8, 20 e 80 mg/kg di genisteina al giorno erano più bassi, rispettivamente, del 17%, 40% e 73% rispetto ai controlli; la genisteina a dosi di 2 mg/kg al giorno non ha prodotto diminuzioni significative. Pertanto, la genisteina fa diminuire il peso del timo nei topi femmina, e lo fa in misura maggiore rispetto all’E2 somministrato a dosi massimamente efficaci. Le osservazioni secondo le quali la genisteina andava a diminuire il peso del timo più marcatamente rispetto all’E2, ci indicavano che i suoi effetti potrebbero non essere mediati interamente dall’ER. Ci siamo chiesti se l’antiestrogeno ICI 182.780 (Astra-Zeneca, Macclesfield, UK) bloccasse gli effetti della genisteina sul peso del timo (Fig. 1). Il peso timico è stato riportato ai livelli  di controllo nei topi ovariectomizzati fornendo E2 (5μg/Kg al giorno) + ICI 182.780 (200 mg/Kg a settimana). Contrariamente a quanto pensato, l’ICI ha bloccato solo il 50% degli effetti della genisteina sul peso timico all’interno del gruppo genisteina (200 mg/kg al giorno) + ICI 182.780 (200 mg/kg a settimana), il che indica come gli effetti di questo isoflavone siano in parte non mediati dall’ER. Per garantire che il trattamento con ICI 182.780 bloccasse completamente il segnale della genisteina mediato da ER, abbiamo misurato i pesi uterini e vaginali, indicatori sensibili degli effetti estrogenici. La genisteina o l’E2 hanno fatto aumentare in maniera marcata questi pesi. In entrambi i gruppi, E2-ICI e genisteina-ICI, i pesi uterini e vaginali erano uguali a quelli dei controlli ovariectomizzati (non mostrati), indicando che l’ICI 182.780 ha completamente inibito le risposte estrogeniche uterine e vaginali a E2 e genisteina. Pertanto, gli effetti della genisteina sul timo, osservati dopo il trattamento con ICI 182.780, si esplicano mediante meccanismi non mediati dall’ER. Questi potrebbero comprendere effetti sulla proteina tirosina chinasi e/o sulla topoisomerasi II, entrambe inibite nei timociti e in altri tipi di cellule da alte concentrazioni di genisteina, come dimostrato in vitro (16, 17). Il peso del timo nei topi maschi castrati trattati con genisteina era di 42 ± 4 mg (n =7), il 49% in meno rispetto ai controlli trattati con DMSO (82± 3 mg, n=4) e il 30% in meno rispetto al gruppo trattato con E2 (60 ± 2 mg; n=7). Tutte le differenze tra i gruppi erano significative. Sia la genisteina che l’E2 hanno prodotto una soppressione a livello timico meno marcata nei maschi rispetto alle femmine, ma la genisteina ha indotto una maggior atrofia timica nei maschi rispetto ad una dose massima di E2 efficace, sottolineando che gli effetti della genisteina sull’atrofia timica sono simili in entrambi i sessi. 

Fig. 1. Effetti della genisteina sul timo. (A) Pesi timici in topi di 100 giorni d’età ovariectomizzati, ai quali sono state effettuate giornalmente 21 iniezioni s.c. di DMSO, E 2 (5 μg/kg), o genisteina (2-200 mg/kg). Ad alcuni topi oltre all’E 2 e alla genisteina (200mg/kg), sono state fatte delle iniezioni settimanali (5mg/settimana) di anti-estrogeno ICI 182,780. La genisteina ha prodotto una diminuzione dose-dipendente del peso timico, che superava quello osservato con E 2 a dosi più elevate di genisteina. ICI 182,780 ha bloccato solo parzialmente gli effetti della genisteina, indicando come la genisteina agisca in parte attraverso un meccanismo non mediato dall’ER. I dati sono riportati come media ± SE; n ≥ 7 per tutti i gruppi. Colonne con differenti lettere ad apice, sono statisticamente differenti. (B) Foto complete dei singoli lobi timici provenienti da topi trattati come descritto in (A)

La genisteina incrementa l’apoptosi dei timociti e diminuisce preferenzialmente i timociti CD4+CD8– e CD4+CD8+

Il numero dei timociti è stato misurato con un emocitometro, per determinare se gli effetti della genisteina comportassero anche una riduzione di queste cellule. Il numero dei timociti nei gruppi DMSO, E2 e genisteina (200 mg/kg al giorno) erano, rispettivamente, 18.3 ± 1.6 x106, 7.0 ± 1.3 x106 e 2.6 ± 0.6 x106, (significative diminuzioni del 62% con E2 e dell’86% con genisteina, tutti i gruppi n=7). La genisteina diminuisce quindi il numero dei timociti in maniera analoga al suo effetto sul peso timico. La riduzione del numero dei timociti, nei topi trattati per 21 giorni con 200 mg/kg di genisteina, era così imponente che non erano disponibili sufficienti timociti per l’analisi dell’apoptosi. Abbiamo quindi trattato i topi con DMSO, E2, o con 80 mg/kg di genisteina al giorno per 7 giorni, e  poi abbiamo quantificato l’apoptosi (11). Il trattamento con genisteina per 7 giorni ha ridotto il peso timico del 62%, solo leggermente inferiore alla diminuzione del 73% verificatasi dopo 21 giorni di trattamento con la stessa dose di genisteina, indicando come i suoi effetti si manifestino molto rapidamente. Le percentuali di timociti nelle fasi relativamente iniziali dell’apoptosi ( indicate dalla colorazione con annessina) nei gruppi DMSO, E2 e genisteina (80 mg/kg) erano, rispettivamente, 0.8 ± 0.2%, 1.8 ± 0.2% e 2.4 ± 0.4% (Fig. 6, che è pubblicata come ulteriore informazioni sul sito web PNAS, www.pnas.org). La colorazione con PI, che identifica le cellule negli ultimi stadi della morte cellulare, è aumentata in maniera analoga dalla genisteina (Figura 6). La colorazione con PI era 2.6 ± 0.3%, 4.6 ± 0.3% e 5.5 ± 0.8% nei gruppi DMSO, E2 e genisteina (80 mg/kg al giorno), rispettivamente (n=6 per ogni gruppo e P < 0.05 per genisteina ed E2 vs. il controllo, sia per la colorazione con annessina che con PI). Questi risultati dimostrano che le diminuzioni del peso timico indotte dalla genisteina si verificano in tempi relativamente brevi, accompagnate da una diminuzione del numero di timociti e da un aumento dell’apoptosi. L’apoptosi dei timociti sembrerebbe essere un aspetto importante riguardante il meccanismo degli effetti della genisteina a livello timico, anche se potrebbero comunque contribuire ulteriori effetti di questo isoflavone su altri processi come la proliferazione cellulare. L’aumento dell’apoptosi dei timociti che ha accompagnato l’atrofia timica indotta dalla genisteina, è coerente con le segnalazioni che indicano come l’atrofia timica indotta dagli estrogeni provochi anche una diminuzione del numero di timociti e un aumento dell’apoptosi (18). Alte dosi di genisteina (200 mg/kg al giorno) hanno comportato una quasi totale scomparsa di linfociti timici CD4+CD8– e analoghe impressionanti diminuzioni nei linfociti timici doppio-positivi CD4+CD8+ (figura 2). Questi effetti erano dose-responsivi, con la dose di 8 mg/kg al giorno che diminuiva le cellule CD4+ CD8–  del 41% rispetto ai controlli (P < 0.01). Le percentuali relative dei timociti doppio-positivi, uno stadio maturativo precoce dei timociti che si sviluppano dai doppio-negativi CD4– CD8–, sono diminuite (circa del 60%) anche a dosi di 8 e 20 mg/kg (P < 0.01). Questi risultati indicano che la genisteina può influenzare la maturazione timica dei timociti e la maturazione della linea CD4+CD8–. Diminuzioni nella popolazione dei timociti doppio-positivi, ma non dei CD4+ CD8–, in risposta agli estrogeni sono state segnalate anche in lavori precedenti (18). Questi risultati indicano che sebbene le diminuzioni osservate nei timociti doppio-positivi possano essere causate dagli effetti della genisteina mediati da ER, riduzioni dei timociti CD4+ CD8–  potrebbero non essere dovute ad azioni mediate da ER. Questa eventualità è in accordo con le nostre osservazioni preliminari che sottolineavano come diminuzioni nelle percentuali relative dei timociti CD4+CD8– potessero essere ancora osservate dopo i trattamenti con genisteina + ICI 182.780 (S.Y. e P.S.C., lavoro non pubblicato). 

Fig. 2. Citometria di flusso delle sottopopolazioni di timociti in topi di 100 giorni ovariectomizzati trattati per 21 giorni con DMSO o genisteina (8, 20 o 80 mg/kg al giorno). I timociti sono stati colorati con dei marker cellulari di superficie per CD4 (ficocianina) e per CD8 (ficoeritrina). In alto a sinistra CD4 + CD8 – . In alto a destra CD4 + CD8 + . In basso a sinistra CD4 – CD8 – (non definiti). In basso a destra timociti CD4 – CD8 + . I dati mostrati provengono da singoli animali, ma le diminuzioni della percentuale dei vari tipi cellulari si basava su n > 6 per tutti i gruppi.

La genisteina diminuisce l’immunità umorale e il numero delle cellule CD4+CD8– spleniche, causando linfocitopenia

Gli effetti soppressivi della genisteina sulla dimensione del timo e sul numero di cellule CD4+CD8– aumentavano la probabilità che essa potesse inibire anche la funzionalità del sistema immunitario. Poiché cambiamenti della funzionalità del sistema immunitario, come risultato di trattamenti sperimentali sul timo, sono più pronunciati nella prima fase della vita piuttosto che in età adulta (19), nelle femmine giovani ovariectomizzate dopo il trattamento con DMSO o genisteina, abbiamo misurato il peso del timo, l’immunità umorale, il numero dei CD4+CD8– splenici e i linfociti ematici. La genisteina a dosi di 8, 20 e 80 mg/kg al giorno, induceva una diminuzione del peso timico rispettivamente del 30%, del 35% e del 64%, rispetto ai topi di controllo trattati con DMSO (n=9-10, P < 0.05 per tutti i gruppi vs. controlli). Pertanto la risposta alla genisteina, in termini di riduzione del peso del timo nei giovani e negli animali di 100 giorni di vita, era comparabile. La genisteina ha prodotto alterazioni dell’immunità umorale (figura 3a), alla dose di 80 mg/kg al giorno riducendo i titoli anticorpali KLH specifici di oltre l’80%, mentre dosi a partire dagli 8 mg/kg al giorno hanno generato una riduzione superiore al 50%. Dati precedenti indicano che la genisteina può diminuire anche l’immunità cellulo-mediata (S.Y. e P.S.C., lavoro non pubblicato), influenzando così sia la componente umorale che quella cellulo-mediata dell’immunità. Sebbene siano già stati stabiliti gli effetti immunosoppressivi degli alti livelli di estrogeni esogeni (20), il presente report indica come gli isoflavoni estrogenici assunti con la dieta (come la genisteina) possano produrre un’immunosoppressione in vivo. Questi topi avevano, con 8 o più mg/kg di genisteina al giorno, anche una diminuzione delle cellule TCD4+CD8– come percentuale di linfociti splenici (figura 3b). Le percentuali delle cellule T CD4–CD8– risultavano significativamente basse solo alla dose massima giornaliera di genisteina di 80 mg/kg (non mostrata). Quindi, la genisteina diminuisce le percentuali relative delle cellule T spleniche e queste diminuzioni sono molto più gravi per quanto riguarda le cellule CD4+CD8–. Questi effetti a livello della milza sono coerenti sia con quelli che la genisteina esplica a livello del timo sia con quelli immunosoppressivi discussi sopra. Le percentuali relative dei linfociti del sangue dei topi geneticamente modificati sono diminuite (Figura 3c), in accordo con gli effetti della genisteina sopra descritti su timo, milza e funzionalità del sistema immunitario. Questa linfocitopenia riflette gli effetti sulle popolazioni di cellule T, ma anche gli effetti inibitori sulla linfopoiesi delle cellule B (21). 

Fig. 3. Titoli anticorpali IgG Anti-KLH (a), percentuale delle cellule TCD4 + CD8 – spleniche (b) e percentuali ematiche relative dei linfociti (c) in topi di controllo e in topi trattati con genisteina. (a) Giovani topi (30 giorni d’età) ovariectomizzati sono stati trattati per 5 settimane con DMSO o genisteina, e sono stati misurati gli anticorpi nel siero anti-KLH per determinare se la genisteina diminuisce la risposta anticorpale. I risultati sono espressi come percentuale di controllo. (b) Percentuale di linfociti T splenici CD4 + CD8 – in topi provenienti da a, misurata mediante citometria di flusso. (c) Percentuale relativa dei linfociti ematici nei topi mostrati in a e in b. Per tutti i gruppi n = 5-9. Tutti i trattamenti con genisteina erano inferiori rispetto ai controlli, ma non erano diversi gli uni dagli altri.

Livelli sierici di genisteina dopo l’iniezione

Una domanda fondamentale è se queste dosi di genisteina inoculate, che inducono modificazioni sul timo e sul sistema immunitario, inducono livelli fisiologici di genisteina e sono potenzialmente rilevanti per i neonati umani nutriti con soia. L’ingestione di un composto porta normalmente ad avere dei livelli ematici più bassi rispetto ad un’iniezione, rendendo difficile il confronto tra le dosi iniettate e quelle ingerite. I roditori, specialmente i topi, metabolizzano la genisteina più rapidamente di quanto non lo facciano gli umani (14, 15). Pertanto è problematico confrontare gli effetti di specifiche dosi di genisteina nei topi e negli umani ed è più rilevante, da un punto di vista fisiologico, esaminare gli effetti sui topi dei livelli circolanti di genisteina simili a quelli presenti nei bambini alimentati con la soia. Per confrontare i livelli sierici di genisteina presenti nei nostri topi inoculati con quelli riportati per i neonati alimentati con soia, è stata misurata (come descritto)  la genisteina totale (aglicone + coniugata) in giovani topi ovariectomizzati, ai quali erano stati iniettati 2-200 mg/kg di genisteina (15). I livelli sierici di genisteina nei campioni di controllo erano inferiori il limite di rilevazione. La dose di 2 mg/kg ha prodotto aumenti transitori della genisteina sierica, ma i livelli più alti erano inferiori rispetto a quelli nei bambini alimentati con soia (figura 4a). Da un punto di vista critico, la genisteina sierica nei topi trattati con 8 mg/kg era paragonabile a quella dei bambini alimentati con soia a 0.5, 1 e 2 ore (Figura 4a), poi i livelli sono scesi a 0.4 ± 0.4 μmol/litro dopo 6 ore e dopo 24 ore non erano più misurabili. A 0.5 e 1 ora dopo l’iniezione, la dose di 20 mg/kg ha prodotto livelli di genisteina sierica da 2 a 3 volte superiori rispetto a quelli più alti riportati nei neonati alimentati con soia. I livelli erano paragonabili a quelli dei bambini alimentati con soia tra le 2 e le 6 ore. Le iniezioni di genisteina da 80 e 200 mg/kg hanno prodotto, rispettivamente, livelli sierici con un picco dalle 10 alle 20 volte superiore, rispetto ai livelli massimi rilevati nei bambini alimentati con soia (figura 4b). I livelli di isoflavone (nei gruppi da 80 e 200 mg/kg) sono rimasti più alti di quelli osservati nei bambini alimentati con soia tra le 6 e le 24 ore. Nei neonati umani di 4 mesi sono stati riportati livelli di isoflavoni plasmatici di 2.0-6.6 μmol/litro (media= 3.7 μmol/litro) e livelli di genisteina di 1.5-4.4 μmol/litro (media= 2.5 μmol/litro)(3). Il valore massimo di genisteina sierica, nei bambini alimentati con soia, è solo di poco inferiore al picco sierico rilevato nei topi dopo una dose inoculata di 8 mg/kg di genisteina e questo persiste per meno di 6 ore, mentre i bambini alimentati con soia, al contrario, hanno livelli elevati relativamente costanti e che perdurano nel tempo, causati dai frequenti allattamenti. Pertanto, la genisteina iniettata a una dose di 8 mg/kg al giorno che produce picchi ematici paragonabili a quelli dei bambini alimentati con soia, induce anomalie del timo e del sistema immunitario.  

Fig. 4. Livelli di genisteina sierica nei topi dopo l’iniezione di (a) 2-20 mg/kg o di (b) 80-200 mg/kg di genisteina. I
dati sono media ± SE e n = 5 per tutti i punti. Le bande ombreggiate rappresentano i range dei livelli plasmatici di genisteina in neonati umani di 4 mesi alimentati con soia (3). (a) La genisteina sierica, dopo una dose di 2 mg/kg, era inferiore a quella dei bambini umani alimentati con soia. La dose di 8 mg/kg ha prodotto livelli di genisteina paragonabili a quelli dei neonati umani nutriti con soia nelle prime 2 ore post iniezione; la genisteina è scesa a livelli minimi dopo 6 ore e non era più rilevabile dopo le 24 ore post iniezione. La dose di 20 mg/kg ha prodotto picchi 3 volte superiori rispetto a quelli dei neonati umani nutriti con soia; poi i livelli sono diminuiti, diventando analoghi a quelli della dose di 8 mg/kg dopo 2 ore dall’iniezione e diventano minimi dopo 6 ore. (b) I livelli di genisteina dopo un’iniezione di 80 o 200 mg/kg hanno mostrato un andamento temporale simile a quello delle dosi più basse, sebbene i livelli assoluti da 0.5 a 6 abbiano superato quelli rilevati nei neonati umani alimentati con soia. Notare le diverse scale in a e b.

La genisteina nella dieta causa atrofia del timo

L’iniezione di genisteina genera una diversa farmacocinetica e un diverso metabolismo dell’isoflavone, rispetto a quando viene somministrata con l’alimento. Era quindi fondamentale determinare se la genisteina assunta con la dieta potesse produrre effetti sul timo paragonabili a quelli osservati dopo l’iniezione. I topi che consumavano mangimi addizionati con 1.000 o 1.500 ppm di genisteina, avevano un timo che pesava approssimativamente dal 10% al 25%  in meno rispetto a quello dei topi di controllo (figura 5a) dopo un trattamento di 12 giorni (rispettivamente, n=18, 20 e 10 per il gruppo di controllo, 1.000 e 1.500 ppm per i gruppi genisteina). Il peso corporeo non cambiava nei gruppi di controllo e nel gruppo “genisteina 1.000 ppm” ed era leggermente più basso ( < 5%) nel gruppo “genisteina 1.500 ppm” rispetto a quello di controllo. Questi risultati sono coerenti con quelli di alcuni precedenti lavori che indicavano come la genisteina nell’alimento a 1.000 ppm non influenzasse il peso corporeo (22) e come la genisteina a 1.000 o a 1.500 ppm non andasse a compromettere il consumo di cibo (22, 23). I livelli sierici di genisteina nei topi alimentati con genisteina a 1.000 e 1.500 ppm erano, rispettivamente, 0.97 ±0.04 e 1.12±0.18 μM, mentre non era stato possibile misurarla in 17/18 campioni di controllo (Fig. 5b).  

Fig. 5. Pesi timici (a) e livelli di genisteina nel siero (b) in topi giovani ovariectomizzati, dopo 12 giorni di alimentazione con una dieta priva di fitoestrogeni o con questa stessa dieta integrata con genisteina da 1.000 o 1.500 ppm. (a) I valori nei gruppi di controllo erano diversi da quelli dei gruppi di genisteina da 1.000 o 1.500 ppm, con P < 0.05 e P < 0.001, rispettivamente; i gruppi genisteina con 1.000 o 1.500 ppm erano diversi, con P < 0.01. (b) I valori dei controlli erano diversi da entrambi i gruppi di genisteina con P< 0.0001, ma i gruppi genisteina non erano diversi gli uni dagli altri.

Questi livelli sierici di genisteina sono analoghi ai picchi riportati nei topi dopo somministrazione orale di genisteina (24), ma sono più bassi rispetto a quelli riscontrati nei ratti che consumano concentrazioni simili di genisteina (14), a causa di metabolismo più rapido della genisteina nei topi (14, 15, 24). I livelli sierici di genisteina nei topi alimentati con 1.500 ppm di genisteina (che induce una diminuzione del 25% del peso timico) sono all’incirca più bassi del 50% e del 70% rispetto ai livelli medi e massimi, rispettivamente di 2.5 e 4.4 μM, riscontrati nei neonati umani alimentati con la soia (3). Questi risultati indicano che nei topi la genisteina alimentare riduce il peso timico già a livelli che inducono concentrazioni sieriche sostanzialmente al di sotto di quelle a cui i neonati umani potrebbero essere di fatto esposti. I nostri risultati, che evidenziano effetti a livello del timonei topi a concentrazioni di genisteina sierica inferiori rispetto a quelle dei neonati umani nutriti con soia, sollevano alcune preoccupazioni sull’eventuale esistenza di effetti sul timo e sul sistema immunitario nei bambini che consumano latte artificiale a base di soia. Uno studio recente su larga scala che coinvolgeva 811 adulti alimentati, come i neonati,  con latte artificiale di soia indicava che la loro crescita era uguale a quella del gruppo di controllo alimentato con il latte vaccino, e il gruppo che consumava la soia non aveva evidenti alterazioni dello sviluppo e della funzionalità riproduttiva (2). Tuttavia, l’unico parametro esaminato relativo alla funzionalità del sistema immunitario, cioè l’utilizzo di farmaci per l’asma o per le allergie, era diverso nei due gruppi. Le donne alimentate come i bambini con latte artificiale di soia, hanno riportato un aumento quasi del 90% dell’utilizzo abituale di farmaci contro le allergie e l’asma, e forse questo è indicativo di un aumento dell’incidenza e/o della gravità di queste condizioni patologiche negli adulti alimentati con latte di soia. Sono necessari studi su larga scala, riguardanti la funzionalità del sistema immunitario o la morbilità nei bambini alimentati con latte artificiale a base di soia, per riuscire a determinare in maniera definitiva l’eventuale esistenza di qualche modificazione, immediata o a lungo termine, del sistema immunitario associata al consumo di questa tipologia di latte, e i dati provenienti da questo studio, il più grande che abbia mai esaminato gli effetti del consumo di latte artificiale a base di soia, non escludono questa possibilità. Inoltre, ci sono dei report nei quali viene messa in evidenza una diminuzione delle gammaglobuline e delle immunoglobuline in neonati alimentati con soia rispetto a quelli di controllo alimentati con latte vaccino (25, 26). Nei bambini alimentati con soia la funzionalità delle cellule T sembrava essere più compromessa rispetto a quella delle cellule B (25). La diminuzione delle immunoglobuline, dei livelli del complemento e i deficit nella funzionalità delle cellule T hanno suggerito che i bambini alimentati con soia potrebbero avere un’immunità umorale e cellulo-mediata maggiormente compromesse. I bambini nutriti con latte artificiale a base di soia hanno effettivamente subito una diminuzione dei titoli anticorpali diretti contro la polio, il tetano, la difterite e la pertosse, rispetto ai lattanti che erano stati vaccinati allo stesso modo ma che venivano alimentati con latte vaccino (27). La morbilità, relativa principalmente ad infezioni delle vie respiratorie superiori e a bronchiti, è aumentata nei neonati alimentati con latte artificiale a base di soia piuttosto che in quelli che consumavano formulazioni a base di latte bovino (25, 27). Pertanto, gli aspetti osservati in questo studio, relativi agli effetti della genisteina sulle cellule T e sulla funzionalità immunitaria nei topi, erano simili a quelli riscontrati in alcuni report condotti sui neonati umani che evidenziavano come  il consumo di formulazioni a base di soia, danneggiasse le cellule T e il sistema immunitario aumentando anche la morbilità. Lo sviluppo delle cellule T è simile nei topi e negli umani, quindi gli studi murini sono potenzialmente applicabili all’uomo (28). Tuttavia, l’estrapolazione dei risultati ottenuti con una specie o con l’altra dovrebbe essere effettuata con estrema cautela, e per quanto riguarda i modelli murini devono ancora essere affrontate questioni chiaramente importanti, come i livelli relativi dell’aglicone e delle forme coniugate di genisteina nei topi che la consumano, rispetto ai livelli presenti nei bambini alimentati con la soia. La recente popolarità di integratori alimentari contenenti proteine della soia o isoflavoni rende possibile l’ingestione, da parte degli adulti, di dosi molto elevate di questi isoflavoni rispetto a quelle che verrebbero introdotte con una dieta ad elevato contenuto di soia. Il consumo di dosi raccomandate di alcuni di questi prodotti, espone gli adulti a livelli di isoflavoni analoghi a quelli ingeriti dai bambini alimentati con soia (a parità di peso) e,  negli adulti che assumevano questi integratori in commercio, i livelli plasmatici di genisteina erano analoghi ai range riscontrati nei neonati nutriti con soia (29) . Gli effetti sul timo e sul sistema immunitario dei trattamenti con estrogeni fetali e neonatali sono ampiamente documentati, e gli estrogeni somministrati ai topi adulti possono causare danni analoghi a quelli evidenziati negli animali giovani (30). Non sono stati condotti studi sul timo e sulla funzionalità del sistema immunitario negli adulti che consumano elevati livelli di integratori, ma questo tema dovrebbe comunque essere affrontato. Tuttavia, uno studio recente sugli effetti di un derivato sintetico dell’isoflavone sull’osteoporosi nelle donne, ha evidenziato  che alcune di esse presentavano linfocitopenia, cosa che era coerente con le nostre scoperte e che ci suggeriva come gli effetti degli isoflavoni sul sistema immunitario documentati qui, potessero spiegare questi risultati (31). In conclusione, alla luce dei nostri attuali risultati e di quelli riportati da altri lavori che suggeriscono l’esistenza di potenziali effetti negativi (a causa dell’elevato consumo di isoflavoni) a carico del sistema immunitario (25, 27), dell’apparato riproduttore (32, 33) e del sistema  endocrino (34, 35) nei neonati o negli adulti, l’utilizzo di latte artificiale per neonati a base di soia e l’assunzione elevata da parte degli adulti di integratori a base di isoflavoni dovrebbero essere condotte con una certa cautela. 

 

Ringraziamo D. Gross, D. Sherwood, D. Bunick, R. Hess, e R. Bigsby per le discussion critiche. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni fatte dal United Soybean Board and Illinois Council on Food and Agricultural Research. 

 

Ringraziamo D. Gross, D. Sherwood, D. Bunick, R. Hess, e R. Bigsby per le discussion critiche. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni dell’United 

Soybean Board and Illinois Council on Food and Agricultural Research. 

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Fonte: www.pnas.org

 www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.102650199