Dal cortisonico al biomarker: approccio multidisciplinare basato su metodi biologici per la lotta ai trattamenti illeciti nel vitello

Sintesi

Nel Piano Nazionale per la Ricerca Residui, il test istologico è impiegato per svelare la somministrazione illecita dei cortisonici. Il progetto di ricerca propone: la verifica della specificità del test istologico, della proteina Paraoxonasi1 e la messa a punto di un metodo di screening basato su tecniche metabolomiche applicate a campioni di urina per indagare il trattamento a basso dosaggio con cortisonici. Nel complesso il progetto si propone di sviluppare e ottimizzare le performance di metodi biologici complementari per implementare una strategia di ricerca dei cortisonici da applicare in ausilio ai metodi chimici ufficiali. Il progetto ha confermato la specificità e la robustezza del timo come organo target e della Paraoxonasi1 quale possibile marker. Lo screening metabolomico ha evidenziato un profilo urinario alterato correlato alla somministrazione di corticosteroidi ai vitelli, aprendo così la strada allo studio di possibili biomarcatori urinari e dei pathway metabolici.

Introduzione

La somministrazione di promotori della crescita è vietata nell’allevamento degli animali in produzione zootecnica dalla Direttiva del Consiglio 96/22/EC, ma l’impiego fraudolento di tali molecole è ancora ampiamente diffuso, sebbene il numero di non conformità riportato nei report annuali di controllo di tali sostanze risulti esiguo, pari allo 0.11% relativamente a cortisonici, β-agonisti ed ormoni sessuali (dati PNR 2014). I dati dei risultati del Piano Nazionale per la Ricerca dei Residui negli animali ed in alcuni prodotti di origine animale mostrano che in linea generale i cortisonici, e il desametasone in particolare, rappresentano le principali sostanze rilevate. Emerge quindi chiaramente la necessità di affiancare prove di screening più efficaci nel discriminare correttamente un uso improprio del farmaco od un suo impiego fraudolento. Studi condotti dal CIBA fino ad oggi hanno evidenziato l’efficacia del test istologico e della proteomica, nello specifico mediante lo studio della proteina paraoxonasi1 (PON1) nell’individuazione dei soggetti trattati illecitamente, ma ulteriori indagini sono necessarie per valutare la specificità del test istologico e contemporaneamente del marcatore proteico. A tal fine nel corso della ricerca sono stati valutati preparati istologici di animali trattati con molecole anabolizzanti quali steroidi sessuali ed in aggiunta sono state valutate quelle di animali con patologie manifeste. Un’ulteriore indagine è stata effettuata per verificare se l’impiego del marker di immunoistochimica Lamin A potrebbe aumentare le performances del test. Si è proceduto inoltre allo studio della PON1 in animali con patologie manifeste in atto e su animali provenienti da aziende sospette di trattamento per la verifica della specificità di tale marcatore proteico. Inoltre è stata correlata la risposta a fenomeni stressori indagati mediante somministrazione di questionari stilati ad hoc per il progetto. Si è proceduto anche all’indagine delle urine degli animali prelevati per la messa a punto di un metodo di metabolomica per lo screening di vitelli trattati illecitamente con cortisonici.

Materiali e metodi

Per verificare la specificità del test e incrementare la potenza statistica del test istologico sono stati valutati campioni di timo di animali trattati con sostanze diverse dai cortisonici, in modo da poterli sottoporre ad analisi microscopica e confrontarli successivamente con gli animali trattati con cortisonici. A tal fine si sono individuati: 10 timi derivanti da vitelli trattati con estrogeni (17β-estradiolo), 10 timi derivanti da vitelli trattati con androgeni (nandrolone) e 10 timi derivanti da vitelli trattati con l’associazione 17β-estradiolo + nandrolone. Da ciascun campione già paraffinato si sono allestite due sezioni seriali rispettivamente colorate con EE e con IHC (anticorpo Cleaved Lamin A). Per ogni preparato è stato assegnato un grado di atrofia del timo (1-lieve; 2-moderata; 3-grave). L’ anticorpo Cleaved Lamin A è stato valutato mediante la conta delle cellule positive in 5 campi microscopici a 200x di corticale. L’ analisi statistica mediante il software GraphPad Prism 6; utilizzando il test Kruskal-Wallis e come post test il Dunn test (P<0,01). Per verificare la validità della PON1 è stato definito un piano di campionamento ed è stato preparato un questionario riportante una serie di informazioni relative agli animali inclusi nello studio al fine di valutare se la scomparsa della PON1 sia da correlarsi solo al trattamento con desametasone ed escludere l’influenza di altri fattori quali: patologie, trattamenti farmacologici, alimentazione, stress.

Durante il progetto sono stati, quindi, raccolti e preparati i campioni di plasma di 45 animali appartenenti ad 8 allevamenti piemontesi. L’urina (n = 102 campioni), corrispondente a 6 date di prelievo diverse, è stata analizzata utilizzando LC-HRMS con la metodica di Dervilly-Pinel et al., 2015. I tre gruppi sono stati divisi come: animali di controllo C (n = 2), animali trattati con Prednisolone (Pred) (n = 10) ed animali trattati con Prednisolone + Desametasone (DesaPred) (n = 5).

Risultati e conclusioni

Il grading per la valutazione dell’atrofia del timo mostra un aumento negli animali tratti con desametasone (media =2) mentre riamane più basso e invariato sia nel gruppo controllo sia negli animali trattati con sostanze diverse dai cortisonici (media =1.2). I conteggi ottenuti dalla colorazione immunoistochimica Cleaved Lamin A sono risultati significativi solo fra animali controllo e trattati con cortisonici mentre non risultano differenza significative tra controlli ed animali trattati con androgeni, estrogeni o la loro associazione. Nella valutazione della PON nessuna delle otto variabili prese in considerazione (allevamento, età, alimentazione, razza, vaccini, malattia, farmaci, stress) sembra interferire nell’individuazione di soggetti sospetti alla PON. Purtroppo, la maggior parte delle variabili rilevate (alimentazione, farmaci, vaccini, stress) riguardano aspetti di management aziendale e per tale motivo non sono state analizzate come valori per singolo capo (come ipotizzato in fase di progettazione dello studio), ma come dato di allevamento. La conseguenza diretta è una drastica diminuzione della numerosità campionaria: da circa una cinquantina di capi, come ipotizzato in fase di progettazione, a solo n=8 allevamenti. La conseguenza indiretta è che, per osservare un effetto statisticamente significativo di una delle variabili di management, tale effetto dovesse essere molto evidente; ad es., per poter affermare che un vaccino è più a rischio di un altro, questo deve essere stato somministrato a (quasi) tutti i capi risultati sospetti ed a (quasi) nessuno dei rimanenti; pertanto, negli allevamenti ove sono stati trovati capi sospetti alla PON (quasi) tutti i capi di questo allevamento sarebbero dovuti risultare sospetti. L’aver osservato al massimo 3 capi sospetti alla PON dei 6 esaminati per allevamento permette comunque di concludere che il marker è specifico e potrebbe essere inserito quale test di screening da applicarsi in campo.

Lo screening metabolomico delle urine, eseguito presso il LABERCA, ha permesso di evidenziare un profilo urinario alterato correlato alla somministrazione di corticosteroidi ai vitelli, aprendo così la strada allo studio di possibili biomarcatori urinari e dei pathway metabolici. Questo approccio risulta importate soprattutto per cercare in futuro di individuare trattamenti illeciti diversi come con i cocktail a bassa concentrazione.

Bibliografia

Guglielmetti C., Mazza M., Pagano M., Carrella S., Sciuto S., Nodari S., Pezzolato M., Richelmi G.B., Baioni E., Caramelli M., Acutis P.L., Bozzetta E. (2014). Identification by a proteomic approach of a plasma protein as a possible biomarker of illicit dexamethasone treatment in veal calves. Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess. 2014; 31(5):833-8.
Dervilly-Pinel, G., Chereau, S., Cesbron, N., Monteau, F., & Le Bizec, B. (2015). LC-HRMS based metabolomics screening model to detect various β-agonists treatments in bovines. Metabolomics, 11, 403-411.
Vascellari M., Pozza G., Poppi L., Capello K., Angeletti R., Ravarotto L., Andrighetto I., Mutinelli F. (2008) Evaluation of indirect biomarkers of corticosteroids use as illegal growth promoters in beef cattle. Vec Rec 163: 147-152